大肠杆菌(大肠杆菌感受态细胞)

大肠杆菌菌落照片如图

大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的，圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。

大肠杆菌为短杆菌，两端呈钝圆形，革兰阴性。有时因环境不同，个别菌体出现近似球杆状或长丝状；大肠杆菌多是单一或两个存在，但不会排列呈长链形状。

大多数的大肠杆菌菌株具有荚膜或微荚膜结构，但是不能形成芽孢；多数大肠杆菌菌株生长有菌毛，其中一些菌毛为针对宿主及其他的一些组织或细胞具有黏附作用的宿主特异性菌毛。

大肠杆菌的生化代谢非常活跃。

大肠杆菌可以发酵葡萄糖产酸、产气，个别菌株不产气，大肠杆菌还能发酵多种碳水化合物，也可以利用多种有机酸盐。

大肠杆菌在常用的生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚产生和乳糖发酵是阳性（个别菌株表现阴性），维-培试验是阴性。

尿素酶和柠檬酸盐利用呈阴性（极个别菌株表现阳性），硝酸盐还原试验表现阳性，氧化酶表现阴性，氧化-发酵试验表现为F型。

大肠杆菌感受态细胞

转化：转化指同源、异源的“裸露”的DNA分子被感受态细胞摄取并实现基因水平转移的过程。

是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

质粒：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。

原理大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA（PlasmidDNA、PhageDNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞（CompetentCell）。

在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。

正在生长的大肠杆菌在0°C下加入到低渗的冰冷的CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀成球（感受态细胞）；感受态细胞与外源质粒DNA形成一种黏着在细胞表面上的对DNA酶抗性的羟基磷酸钙复合物。

42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞吸收。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。

用一定浓度的CaCl2处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。

对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

这种转化方法称为“化学法”。

目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。

步骤

（1）感受态细胞的制备

1）挑取大肠杆菌划线于LB平板上，在37℃恒温培养过夜(16-18h)。

2）挑取单菌落于50mLLB培养基中37℃、200r/min培养3-4h，至出现薄雾状菌悬液即可。

3）将培养液置于冰上预冷15min，并间断轻轻摇动。

4）将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL离心管中。

5）在冷冻离心机中离心，4℃3000r/min离心5min。

6）弃上清、加入15mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,轻轻旋转，使细胞充分重新悬浮，冰上放置20-30min。

7）于4℃3000r/min离心5min。

8）弃上清，加入2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻旋转，使细胞充分重新悬浮，5min后就可以用于转化实验，或添加保护剂，低温或超低温冷冻贮藏备用。

（2）感受态细胞的DNA转化

1）取100µl的感受态细胞置于冰中融化20-30分钟。

2）于超净台中取质粒1μl（2ng/μl）与100μl大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟。

3）42℃水浴中热激90秒钟后，立即于冰中放置5分钟。

4）加入0.9ml37℃预温的LB培养基，在37℃200r/min温育30-45分钟。

5）将菌液1000rpm/min离心2min，取80μL均匀涂布在含有适量抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜，观察实验结果并记录。

注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。

注意：

1.制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。

洗刷这些玻璃器皿或塑料容器时应尽量洗净。

由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率，因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去离子水浸泡一晚，然后再充分洗净。

2.制作感受态细胞时使用的菌种，不应使用4℃或常温保存的传代细菌。应使用-70℃保存的菌种，在LB抗生素平板培养基上分级划线培养后，挑取单菌落。使用这种菌种制作的感受态细胞，能提高转化效率。

3.菌体的浓度是影响感受态效率高低的主要因素，适于本法的菌体浓度应在OD600值0.05-0.11之间。

4.用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理，不要将培养液过长时间室温放置，在冰中放置时也不要时间过长。

5.感受态细胞的制备操作过程中，离心后弃上清时要尽量弃尽，否则会降低感受态细胞的转化效率。

6.主要的转化操作都是无菌操作，并且在冰上进行。