重组DNA的六个步骤

基本步骤

1目的基因的获得

方法有：基因文库（cDNA文库、基因组文库）、PCR（放达效应）、人工合成。

2目的基因与载体连接

方法有：

——粘性末端——全同源性、定向克隆（两种酶切）。

定向克隆可防止高背景的产生，因为全同源性会造成载体自连、重组子、目的基因自连三种可能，重组子可能还会出现正反插入的情况，使筛选过程复杂。

——平末端

酶切后也有可能产生平末端，也会出现高背景。

——人工接头——连接子（连入带粘性酶切位点的片断，再酶切）、普适子（一条链连上片断，成为粘性末端）、T-A克隆（PCR中使用的Taq聚合酶会根据模板延伸至后在链末尾加上一个A，可在克隆载体上加上T，使之连接）、同聚物加尾（末端转移酶加尾）。

由于平末端连接效率比较低，可在其两端人工修饰。

反应体系：目的基因、载体、T4连接酶、缓冲液。

3重组DNA导入受体（宿主）细胞——转化、转染、转导、感染。

主要运用的是原核转化（导入感受态细菌，感受态：处于易于吸收外缘DNA的状态，方法：氯化钙法：DNA与其形成羟基-磷酸钙复合物，抗DNase水解）、真核转染。

4筛选与鉴定

方法：

——遗传学（表形）——插入失活、蓝-白筛选、抗性基因（四环素Tet、氨苄青霉素Amp）。

——酶切，在电泳（分子量、构想）

——PCR（特异性引物）

——核酸杂交（southernblot）

——免疫学方法（westernblot）

——DNA测序（sanger、焦磷酸测序）

重组dna的六个步骤是什么

DNA重组技术，是当今生物科学领域内的一种尖端技术。

具体而言，这一技术通过人工操作，将不同生物体来源的特定基因片段进行重新组合，从而实现对生物基因类型的改变，进而获得具有特定功能的基因产物。

这一过程主要包含了基因提取、片段切割、DNA片段重组以及重组体导入受体细胞等多个步骤。

在基因提取阶段，通过特定的技术手段，从特定生物体中分离出包含所需基因的DNA片段。随后，利用限制性内切酶等工具，将这些DNA片段进行切割，形成可进行重组操作的单个DNA片段。

接下来，便是关键的DNA片段重组阶段。

研究者需要根据实验目的，将不同来源的DNA片段通过特定的连接酶等工具，重新拼接在一起，形成一个包含多种基因的新DNA序列。

这一过程要求极高的精确度与操作技巧，稍有不慎便可能导致重组失败。

重组完成后，研究者需要将这一新合成的DNA序列导入到受体细胞中。通过病毒感染、质粒转化等方法，将重组DNA序列成功整合到受体细胞的基因组中，从而实现基因型的改变。

在这一技术的支持下，科学家们能够创造出具有特定功能的生物体，用于药物研发、农业生产、环境保护等多个领域。

DNA重组技术，不仅极大地推动了生物科学的发展，也为我们探索生命的奥秘、解决人类面临的诸多问题提供了全新的思路与方法。