cDNA文库构建的基本步骤不包括(cdna文库构建的基本步骤不包括哪些)

一般生物制药的主要流程如下：1.上游阶段。

1.1目的基因的制备

目的工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中,创造出具有高度应用价值的新物种.为此必须从现有生物群体中,根据需要分离出用于克隆的次类基因,这样的基因称之为目的基因.基因工程中获得的目的基因主要用于:(1).研究该基因,分析其结构,功能和表达的调空机制(2).和正常基因比较,找出基因的异常点,探索疾病发生的分子生物学基础.(3).研究生物种系的进化(4).建立基因疗法,将正常基因引入病人体内,治疗遗传性疾病(5).大量表达某种基因,生产出需要的蛋白和多肽(6).对某些基因进行改选,改良动植物品种.

不同基因组类型的基因组大小不同,基因组和基因排列也各不相同,因此,分离目的基因应采用不同的途径和方法。

1.1.1构建cDNA基因文库分离法

cDNA文库是以真核细胞中分离纯化出所有的mRNA,在以mRNA为模板合成cDNA与适当的载体重组转入宿主细胞,这样建立起来的cDNA重组分子集合体称为cDNA文库.而cDNA文库中插入片段的总和可代表某一种生物全部的mRNA序列.

1.1.1.1cDNA文库的构建

构建cDNA文库主要包括以下步骤:(1).细胞总RNA的制备及mRNA的分离(2).以mRNA为模板,合成cDNA第一条链(3).双链cDNA的合成,而将mRNA—DNA杂交分子转变为双链cDNA分子(4).CDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及传染或质粒的转化等。

1.1.1.2cDNA克隆的优越性

自20世纪70年代初说创cDNA克隆问世以来,以采用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了许多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也长以cDNA为探针从基因文库中分离相应的基因克隆.因此,cDNA克隆常常以基因分离和结构分析的着手点,在分子生物学研究和基因工程应用等方面具有十分重要的意义.

1.1.2构建基因组文库分离法

1.1.2.1基因组文库的概念

将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,分别与适合的载体重组后导入宿主细胞,这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列.这种通过重组,克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组文库.

1.1.2.2基因组文库的大小

克隆片段的平均大小/bp基因组的大小/bp。

2×10^6(细菌)2×10^7（真菌）3×10^9（动物）。

LNSJLNSJLNSJ

5×10^340018314000184186000002736110。

10×10^3200919200092083000001381550。

20×10^310045810004603150000690774。

40×10^350278500230075000345386。

一个理想的基因组文库因该是在克隆群体中包含完整基因组的所有DNA序列.这就要求在打断基因组DNA时尽可能做到随机切割,实际上,无论采用什么方法的不能达到理论上的切割.应此构建的基因组文库应包含的克隆子数理论值和经验值之间相差比较大.几类基因组文库的大小见下表:「2」。

1.1.2.3构建基因组文库的类型

通过克隆，重组方法构建的基因组文库主要有：

(1)构建λ噬菌体基因组文库；（2）构建考斯质粒基因组文库。

(3)构建YAC基因组文库

1.1.3直接分离法

1.1.3.1限制性核酸内切酶酶切分离法

限制性核酸内切酶酶切分离法适于简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几万碱基，编码的基因较少，获得的目的基因方法比较简单。

1.1.3.2基因分离的物理化学法

这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的，但目前很少采用。次方法主要有：密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。1.1.3.3双抗体免疫法分离编码蛋白的基因。

双抗体免疫法分离编码蛋白的基因适于某一真核细胞的蛋白质已被分离纯化，且足以产生抗体。

1.1.3.4利用酶促反转录发直接从特定mRNA分离基因。

酶促反转录主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。

目的基因的mRNA为模板逆转录酶cDNADNA聚合酶双链双链cDN**段。

与合适载体重组并转入受体菌cDNA克隆

1.2目的基因的分离

通过适当的方法构建上一个完整的基因组DNA文库或CDNA文库，意味着包含目的基因在内的所有基因都得以克隆，但并不等于完成了目的基因的分离。

因为在基因文库中，不论是CDNA文库还是基因组文库，含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个，其中究竟哪个克隆子含有我们所需要的目的基因序列还不清楚。

因此，还需要下一个步骤要进行的就是目的基因的分离，主要方法有：

（1）目的基因的功能克隆（2）序列克隆法

（3）利用差示分析法分离目的基因克隆（4）功能结合法筛选目的基因。

（5）DNA插入诱变法分离目的基因（6）应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因。

（7）基因的定位侯选克隆法（8）染色体显微切割与微克隆法。

（9）根据生物大分子内的相互作用分离目的的CDNA克隆。

（10）筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术。

1.3基因克隆载体

载体是携带目的基因的DN**段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。常用的载体是经过改造的细菌质粒，噬菌体，黏粒和病毒。

1.3.1质粒克隆载体

质粒是细菌染色体外的双链环状的能自我复制的小分子DNA，其对细胞本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的类型，如耐热型等。

与构建克隆载体相关的质粒性质有：

（1）粒的复（2）制型（2）质粒的不（3）相容性。

（3）质粒的接合性

（4）质粒作为基因工程载体需要具备的条件：作为基因工程载体的质粒都是经过人工改造过的质粒，具备以下特点：

a,相对分子质量小3—10kbb,是松弛型复制质粒。

c,是非接合型质粒c,质粒上有多个限制酶的单一切点。

d,带有双选择标记

1.3.2病毒（噬菌体）克隆载体

病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。

通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制的壳蛋白质的合成，实现病毒颗粒的增殖。

人们利用这些性质构建了一小列分别适用于不同生物的病毒克隆载体。

通过此种方法构建成的基因克隆载体主要有：

（1）噬菌体克隆载体cosmid克隆技术（黏粒）（2）Μ13噬菌体克隆载体。

（2）aMV克隆载体（4）烟草花叶病毒（TMV）载体克隆。

（5）SVCO克隆载体（6）反转录病毒克隆载体。

（7）腺病毒克隆载体（8）痘苗病毒克隆载体。

（9）杆状病毒表达克隆载体

1.3.3其他类型的克隆载体

（1）染色体定位整合克隆载体（2）人工染色体克隆载体。

（3）特殊用途克隆载体：如启动子探针型，（4）诱导型，（5）反义表达组织特异表达，（6）分泌型表达，（7）双启动子，（8）串族启动子和含增强子表达克隆载体等等。

1.4目的基因和载体的连接（重组）

目的基因和载体连接前要先用同一种限制酶将目的基因和载体切割成黏性端或平端，也可以用物理方法切割后再用酶补成平端。

体外连接是基因工程的重要环节，体外连接要减少载体的自身环化，提高重但子阳性率。主要的连接方法有：黏性末端连接、平端连接、定向插入和同源多聚尾。

1.5重组体导入受体细胞

外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组的DNA分子。

该重组DNA分子必须导入适宜的受体细胞在中才能使外源目的基因得以大量扩增或表达。

随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步达到结构复杂的高等动，植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。

选择适宜的受体细胞已经成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一

1.5.1受体细胞的选择要求

目的基因获得后,必须在合适的宿主细胞中才能进行表达,才能获得目的产物.应此,宿主细胞必须满足:容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价的材料;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行DNA重组技术操作技术;产物的产量、产率高,产物容易提取纯化.

1.5.2受体细胞的类型

人们通过研究,根据需要获得了一定的目的产物,而目的基因能否的到有效的表达,关键在与受体细胞的选择.

1.5.2.1原核生物细胞

由于原核生物作为基因工程受体具有其他生物所没有的优点,而且人们对其遗传背景清楚,所以早期开展的基因工程操作,都是以原核生物为受体细胞.目前研究比较多的有:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等.

1.5.2.2真核生物细胞

由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂,适用于原核生物的转基因方法大多数难以有效地用于真核生物.近年来经过探索,发现它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程,有利于保持天然结构和生物活性.并用这些方法有效的获得了转基因真核生物.研究较多的有:酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等等.

1.5.3重组子的筛选

在重组DNA分子的转化、转染和转导过程中,并非所有的的受体细胞都能被导入重组DNA分子.一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞,同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖.因此,如何将被转化细胞从大量受体菌细胞中初步筛选出来,然后进一步检测到含有期待重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和工程操作红极为重要的环节.

重组子的筛选可以根据载体的类型、受体细胞种类以及外源DNA分子导入受体细胞的手段等采用不同的方法,一般包括以方面:。

(1).遗传直接筛选法;(2),核算分子杂交检测法;(3)依赖于重组子结构特征分析的筛选法;。

(4)免疫化学检测法;(5)转译筛选法;(6)亚克隆法;(7)插入失活法;。

(8)电子显微镜作图检测法;(9)基因表达产物分析法;(10)DNA序列分析法.

1.6、外源基因的表达

基因工程技术的核心是基因表达技术。迄今为止，已构建了多种基因表达系统，包括原核生物和真核生物基因表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。

1.6.1基因表达的机制（过程）

1.6.1.1外源基因的起始转录

外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键。

1.6.1.2mRNA的延伸与稳定性

外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。

mRNA的稳定性直接导致决定翻译产物的多少，对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失受体前。对真核细胞来说则需考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。

1.6.1.3外源基因mRNA的有效翻译

翻译是mRNA指导多肽链生成的过程，翻译的起始是多种因子协同作用的过程，其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之间的碱基配对，还有mRNA序列上的终止密码对正确翻译的效率有很大影响。

1.6.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性

外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素，因此，为了避免此现象的发生可从以下几个方面考虑：

（一）构建融合蛋白表达系统;（二）构建分子体蛋白表达系统;。

（三）构建包涵体表达系统;（四）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统.

1.6.1.5目的基因沉默

基因沉默是导致外源基因不能正常表达的重要因素。它的作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主要表现在转基因动物和植物中。

目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA,DNA与RNA,RNA与RNA相互作用的结果。

由于重复序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一，因而在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列具有较高的同源性。

此外，可以通过选择甲几基化酶活性较弱的受体细胞或以化学物质处理受体细胞抑制甲基化作用。

1.6.2基因表达的调控元件

通过研究发现主要的基因表达调控元件有：启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子和反义子。

1.6.3外源基因表达系统

外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效的表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。

由此可知，外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。

基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。

目前，利用较多的是原核生物表达系统，因其遗传背景清楚，繁殖快，表达率高等特点。

近年来，真核生物基因表达系统发展很快，因其可以对表达的蛋白质进行翻译后加工过程，有利于保持天然结构和生物活性等优点。

目前主要应用的表达系统有：大肠杆菌基因表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞基因表达系统、植物细胞基因表达系统；还有最新研究的两个新的表达系统[3]：巴斯德毕赤酵母表达系统和动物乳腺生物反应器——全新的生产模式。

2、下游阶段

基因工程只要的过程关键在于上游阶段，因它可以获得有效的工程菌，但下游纯化阶段也必不可少。因此为了获得合格的目的产物，必须建立相应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。

2.1、基因工程菌发酵：

良好的发酵工艺对表达外源蛋白至关重要，直接影响下游纯化工艺，形象到产品的质量和生产成本，决定产品在市场上的竞争力。

目前，基因工程菌培养常用方法有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定培养。

近年来，生物药品已进入生物技术时代，对基因工程菌的培养设备要求十分严格，主要采用新型自动化发酵罐。

2.2、分离纯化的基本过程：

分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的

一环,这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的。

有效成分含量低，杂质含量高；另外由于基因工。

程药物是从转化细胞，而不是从正常细胞生产的，。

所以对产品的纯度要求也高于传统产品，主要的。

步骤如右表：[4]

2.2.1、建立分离纯化工艺根据

主要根据：（1）含目的产物的起始物料特点;。

（2）物料中杂志的种类和性质;

（3）目的产物特性;

（4）产品质量的要求.

2.2.2、选择分离纯化方法的依据：

主要依据：

(1)根据产物表达形式来选择;

(2)根据分离单元之间的衔接选择;

(3)根据分离纯化工艺的要求来选择.

2.2.3、常用的分离纯化方法（见下表）[5]。

方法目的

离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质(如病毒)。

阴离子交换层析去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等。

阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等

超滤去除沉淀物及病毒

疏水层析去除残余的杂蛋白

凝胶过滤与多聚体分离

0.22μm微孔滤膜过滤除菌

3、基因工程药物：

自20世纪80年代初第一种基因工程产品——人胰岛素投放市场以来，以基因工程药物为主导的基因工程应用已成为全球发展最快的产业之一。

随着生物技术的快速发展，基因工程药物将拥有越来越广阔的发展前景。

基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等，它对预防和治疗人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿疾病等有重要作用。

3.1、基因工程激素类药物

激素是一类由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。

基因工程的激素类主要指通过基因工程方法合成的蛋白多肽类激素。

目前被批准上市的激素类药物有胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素等。

3.2、基因工程细胞因子类药物

细胞因子是由细胞分泌的能够调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖，分化和凋亡的小分子多肽类物质。

目前被批准上市的产品有十多种。

主要有：干扰素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF），趋化因子和生长因子（GF）等。

它们的生物学功能主要表现为：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节机体造血功能和促进炎症反应等。

3.3、基因工程疫苗：

直接利用微生物制备疫苗来治疗疾病取得了巨大的成就，但由于各种传染病在世界范围内广泛存在，并不断有新的致病微生物被发现，它们对人类的健康造成巨大威胁。

利用基因工程方法制备疫苗对控制传染病的复发和治疗新的传染病有重要意义。

目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍乱菌苗、结核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、疟疾疫苗、口蹄疫疫苗。

3.4特殊基因工程药物—防御素

防御素是一类在生物界广泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些恶性细胞抗性的小分子短肽.它的抗性谱十分广泛,目前以发现它不但对细菌、真菌和被膜病毒(如爱滋病病毒)有广泛的毒杀效应,对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用.最近,对一些长期存活的爱滋病感染者的研究发现,他们体内的爱滋病抑制因子就是一类防御素.这一研究发现给人们战胜爱滋病带来希望.

4.基因工程研究发展前景

基因工程问世以来短短的二十几年,显示出了巨大的活力,使传统的生产方式和产业结构发生了变化.特别是在医药行业,利用人工的方法合成了许多有用的药物及人体器官等,取得了很大的经济效益.今后,基因工程将重点开展基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面的研究.通过这方面的研究、开发,对人类的生活、生存环境从根本上优化做出巨大的贡献.因此,我们相信基因工程的前景将是更加灿烂辉煌.

cdna文库构建的基本步骤不包括哪些

目的基因的获得

从事一项基因工程，通常总是要先获得目的基因，倘若基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者利用聚合酶链式反应（PCR）由模板扩增。

此外，最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库或cDNA文库，从中选择出目的基因进行克隆。

（一）基因文库的构建

基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。在理想条件下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。通常包含以下五个步骤：

1．染色体DNA的片段化：利用能识别较短序列的限制性内切酶对染色体基因组进行随机性切割产生众多的DNA片段。

2．载体DNA的制备：选择适当的λ噬菌体载体，用限制性内切酶切开，得到左右两臂，以便分别与染色体DNA片段的两端连接。

3．体外连接与包装：将染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白在体外包装（图8-1-4）。

图8-1-4基因文库的建立

4．重组噬菌体感染大肠杆菌：重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入细胞，重组DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生的溶菌产物组成重组噬菌体克隆库，即基因文库。

5．基因文库的鉴定、扩增与保存：构建的基因文库应鉴定其库容量，需要时可进行扩增。构建好的基因文库可多次使用。

（二）cDNA文库的建立

真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。

真核生物由于外显子与内含子镶嵌排列，转录产生的RNA须切除内含子拼接外显子才能最后表达，因此真核生物的基因是断裂的。

真核生物的基因不能直接在原核生物表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），再接上原核生物的表达控制元件，才能在原核生物中表达。

还有，mRNA很不稳定，容易被RNA酶分解，因此真核生物须建立cDNA文库来进行克隆和表达研究。

所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

建立cDNA文库与基因文库的最大区别是DNA的来源不同。

基因文库是取现成的基因组DNA，cDNA文库是取细胞中全部的mRNA经逆转录酶生成DNA（cDNA）（图8-1-10），其余步骤二者相类似。

构建cDNA文库的基本步骤有5步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA（质粒或λ噬菌体）；④双链cDNA的克隆（cDNA与载体的重组）；⑤cDNA文库的鉴定、扩增与保存。

（三）基因库中克隆基因的挑选分离

基因文库和cDNA文库建立起来后，下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆，这是一件难度很大，费时费力的工作。

一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体（参见图8-1-3），这种方法叫做“选择”；另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查，这种方法叫做“筛选”。

1．原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十分灵敏而且快速的方法，基本步骤如图8-1-5所示。

图8-1-5原位杂交直接选择DNA重组体

上图用于杂交的探针可以是双链DNA，也可以是单链DNA，或是RNA。杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。

显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。探针的获得有如下方法：

①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。

②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以用同源序列做探针。

③如果目的基因未知，但知道它对应的蛋白质序列，可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。

2．扣除杂交法：这是一种筛选方法，难度很大，是面对目的基因未知，同源基因未知，蛋白质序列未知的情况的。

基本原理是找到该基因的高表达细胞，提取相应的mRNA，并与一般细胞提取的mRNA进行比较，分离一般细胞不存在而高表达细胞存在的mRNA，然后用该mRNA逆转录生成cDNA。

（四）聚合酶链式反应扩增目的基因

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是DNA体外酶促扩增，故又称无细胞分子克隆。

它模仿体内DNA反复复制的过程，用DNA聚合酶在体外合成DNA。

1985年由MulisK发明。

PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段，能在实验室里的一支试管内，将所要研究的一个目的基因或某一DNA片段，在数小时内扩增至百万乃至千百万倍，使得皮克（pg）水平的起始物达到微克（μg）水平的量。

只要一根毛发、一个精子、一滴血的DNA样本，或福尔马林固定、或石腊包埋、或冷冻数万年的组织，都可用于基因结构的分析。

PCR现已成为生命科学实验室获取某一目标DNA片段的一种常规技术，已广泛地应用于医疗工程、生物工程、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医学和考古学等领域。

。

1．基本原理

PCR方法模拟体内的DNA复制，首先加热使DNA双链变性为单链，然后退火（降温）至变性温度点以下，单链DNA与加入的小片段DNA引物复性，随后适宜温度下在耐热的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）作用下自引物延伸子链。

不断重复高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，使样品DNA大量扩增（图8-1-6）。

图8-1-6聚合酶链式反应示意图

2.PCR的反应条件

①模板DNA（需扩增的目的基因或序列）；

②2种不互补的DNA片段引物；

③4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）；

④耐热DNA聚合酶；

⑤缓冲液。

3．温控

反应开始时94℃加热5～10min使DNA完全变性，然后进入循环。每一轮循环包括：

①加热，94℃，45s，高温促使DNA变性成单链；

②退火，55℃，1min，使单链DNA与引物粘合；

③延伸，72℃，1～1.5min，TaqDNA最适温度促使DNA子链自引物延伸。

最后一次循环时延伸时间延长到10min，促使所有子链充分延伸。最后通过电泳分离进行分析。

4．应用

①在分子生物学的一些应用：产生大量已克隆化双链DNA中的特定序列，从少量mRNA生成cDNA文库，选择性扩增特定的cDNA区段，生成大量单链DNA进行序列测定，构建突变体和重组体等。

②在细菌类疾病诊断中的应用：分枝杆菌、淋球菌DNA检测。

③对病毒类疾病诊断中的应用：人类巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒的检测。

④在遗传疾病诊断上的应用：PCR已有效地应用于诊断单基因疾病及产前诊断和携带者的检测。

第一个应用PCR进行产前诊断的疾病为镰刀形红细胞贫血症。

目前，国内外许多单位采用此法来诊断多种遗传性疾病。

如镰刀形红细胞贫血、地中海贫血、血友病A、血友病B、Duchenne肌萎缩、囊性纤维变性、神经纤维瘤、成年多囊肾、视网膜母细胞瘤等。

⑤在肿瘤诊断上的应用：与人类肿瘤相关基因研究最多的为ras基因族，ras基因族包括H-ras、K-ras及N-ras三类基因，该族基因的第12、13及61位密码最易发生点突变，以后便获得了转化潜能，产生ras癌基因。

具转化潜能的ras基因广泛存在于多种肿瘤细胞系，有时也存在于人的肿瘤组织内。

根据这三类基因的DNA顺序，设计引物，将包括点突变部位的DNA进行PCR扩增，再根据正常的顺序及可能发生突变的顺序设计合成并成多种探针，用标记的探针与PCR扩增DNA杂交，即可判断是否有突变。

⑥在法医物证学上的应用：种属鉴定、性别鉴定、个人识别、亲子鉴定。

⑦在器官移植上的应用：器官移植是治疗重要器官晚期实质性病变所致功能衰竭的最好办法。

目前，常进行移植的重要器官有骨髓、肾、心、胰、肝等。

成功的器官移植受者能够接近正常人一样地生活和劳动。

器官移植的成功与否，关键的问题之一是宿主对移植器官是否产生排斥反应，以及反应的强度。

因此，实现器官移植的一项重要内容就是进行人的组织相容性系统的测定。

目前流行的测定HLA的方法主要是血清学方法和细胞学方法。

但是，这两种方法均有操作繁琐、材料来源困难、保存要求高、花费时间长等缺点。

而且，以上述方法，HLA的某些等位基因仍无法检测。

PCR技术的建立和发展，使得对HLA基因进行直接测定成为可能。

它能直接作基因分型，具有操作简单、方便、快速、灵敏等特点，而且不会受抗HLA血清和活淋巴细胞等方面的限制，对器官库的建立将提供十分有用的技术手段。

（五）获得目的基因的其他方法

如果基因序列完全已知，可以通过化学方法进行人工合成。通过定位诱变也可以获得突变基因。