免疫沉淀(IP)是一种通过结合抗体与固相载体来富集目的蛋白的技术。
这一过程利用了抗原抗体间的特异性反应。
常用的固相载体包括免疫磁珠和亲和凝胶。
免疫磁珠借助磁性吸附,能快速且精准地从混合体系中分离抗原抗体复合物,且可配合自动化高通量检测仪使用。
亲和凝胶则通过离心分离目的蛋白,其更大的粒径和更高的抗体载量提供了更强的吸附能力,尤其在靶蛋白丰度较低时,能有效地富集目的蛋白。
免疫共沉淀(Co-IP)是一种基于抗体和抗原专一性作用的经典蛋白质相互作用研究方法,它是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效手段。
在非变性条件下裂解细胞,并在细胞裂解液中加入特异性的抗体,抗体与已知抗原形成抗原-抗体复合物。
若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,它们也会以复合物的形式沉淀下来。
随后通过洗脱可得到与已知抗原相互作用的蛋白质,并进行SDS-PAGE及Westernblotting等分析。
以proteomeA/G凝胶磁珠为例,IP/Co-IP的实验操作流程涉及IP抗体的选择。
若涉及目的蛋白带有标签,如Flagtag、HAtag等,可以选择IP级别的抗体并配套相关凝胶/磁珠,或者直接选用相关标签蛋白抗体凝胶/磁珠。
IP实验中常见的常见问题包括裂解液中去垢剂浓度过高或配方过于剧烈,可降低此类去垢剂浓度或更换去垢剂;受蛋白的亚细胞定位影响,应重新选择裂解液配方以释放目的蛋白;蛋白与蛋白之间相互作用太弱或不稳定。
免疫共沉淀实验失败的原因有哪些?
ip抗原偏高是怎么回事
IP就是免疫共沉淀Immunoprecipitation的缩写。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在agarosebeads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的,符合体内实际情况,得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
优点
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
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