蛋白质工程的原理和应用

通过多聚酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是有利的），包括碱基对的增添、缺失和替换等。

定点突变能迅速，高效地改变DNA所表达的目的蛋白，从而影响生物性状，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

定点突变需要设计特定的突变引物。

引物长度一般为25-45bp，建议选择30-35bp长度的引物p。

引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求引物两边都能与模板搭上，所以引物的两边各设至少12个bp。

定点突变实验注意事项

1、引物设计时须参照引物设计原则，注意引物中的GC含量，引物长度等，可在引物的两端选择G或者C，可以提高引物和模板结合的概率。

2、PCR过程中未得到相应大小条带或条带不单一，应适当调整退火温度，已调整聚合酶和引物的特异性。

3、使用一轮PCR产物进行第二轮PCR时，需等量加入作为模板的PCR产物的mol量。

4、某些特殊的限制性酶切酶处理基因时需要进行65℃灭酶处理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使内切酶变性和DNA分离。

5、连接后转化，注意载体中的抗性基因，可以设置空白对照，已转化后得到的单菌落数量评估获取阳性克隆的概率。