蛋白质工程的基本流程(蛋白质工程的基本流程正确的是)

1.切出黏性末端的限制性核酸内切酶对回文片段才能识别，那么切出平末端的内切酶是否也一定要回文片段？是的。

因为：限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。

有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoRI、BamHI、Hind等)，因而可形成粘性末端，另一些II类酶如AluI、BsuRI、BalI、HalIII、HPaI、SmaI等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。

2.蛋白质工程的操作流程是不是和基因工程里的第一步骤【获取目的基因】的人工合成法式一模一样的。

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为什么看老师给出的两个流程图感觉没有多大差别呢><。

蛋白质工程是从蛋白质逆向推导至基因的，而基因工程是从基因出发推至蛋白质的，一个正向一个反向。

因为：蛋白质工程是根据预期的蛋白质功能-----推知蛋白质的三维结构-----设计氨基酸序列------推知信使RNA——逆转录——DNA序列——转录——翻译的方向进行的，而基因工程只能按照中心法则的顺序进行。

而且蛋白质工程可以得到自然界中不存在的蛋白质，而基因工程只能得到自然界中已经存在的蛋白质。

蛋白质工程的基本流程正确的是

所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。

蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。

可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。

由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。

而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。

蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。

这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。

蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。

其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。

在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。

目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。

一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。

实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。

从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。

蛋白质工程的基本途径从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）【研究的核心内容】蛋白质结构分析蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。

三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有生物功能的必需手段。

晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。

另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。

核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，这种方法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。

现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。

从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。

国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白质。

结构、功能的设计和预测根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。

通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。

虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

创造和改造蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。

物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。

以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用，缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。

采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。

蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的。

氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。

而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。

在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。

一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。

定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。

通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性或催化特性。

噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。

将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。

经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。

再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。

盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。

利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。

这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。

以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。

分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。

这种方法直接、快速和高效。

高突变率技术从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。

有两种新的突变方法具有较高的突变率：①硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；②UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。

用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制。

蛋白质融合将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。

这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。

现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。